Nat. Commun. | 非柔性eunicellane二萜碳骨架合酶MicA的发现与机制解析

2024-07-16 16:25

2024年7月15日，烟台新药创制山东省实验室郭跃伟团队、徐宝福团队联合中国科学院上海感染与免疫研究所王程远教授团队、中国海洋大学王长云教授团队在国际期刊Nature Communications杂志上发表题为“Discovery of a terpene synthase synthesizing a nearly non-flexible eunicellane reveals the basis of flexibility”的研究论文，系统地针对非柔性eunicellane二萜骨架合酶的生物合成机制以及相关的非柔性机理进行了研究，回答了eunicellane家族化合物特有的构象动态变化问题，为eunicellane家族化合物的合成生物学生产体系构建以及构象控制等奠定了一定的理论基础。

Eunicellane家族天然产物是一种具有独特6,10-双环碳骨架的二萜化合物。这一类天然产物大多显示出良好的生物活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗菌和抗污等，这使其成为药物开发的重要候选化合物，同时也吸引了一批全合成化学家的关注，将其视为具有挑战性的合成目标类化合物，例如具有和紫杉醇同等活性级别的eleutherobin。世界上首个eunicellane家族化合物为eunicellin，是由“避孕药之父”Carl Djerassi教授团队于1968年从珊瑚Eunicella stricta中分离得到。其之后至今，从珊瑚、植物以及微生物内分离得到约四百多个eunicellane化合物，多种多样的eunicellane天然产物不仅为药物的研发提供众多候选分子，也为新型修饰的酶催化剂鉴定提供了目标分子（图1）。然而，eunicellane家族化合物含量比较低。以珊瑚为例，目标化合物约占鲜重的百万到千万分之一。此外，多数的eunicellane天然产物下游修饰的生物合成途径都是未被解析的，导致eunicellane家族化合物的药物研发举步维艰。因此，解析eunicellane的生物合成途径，构建绿色高效的生物合成体系，对于推动eunicellane家族化合物的药用价值开发具有重要的意义。

图1. Eunicellane 二萜的举例及分布。

世界上首个关于eunicellane天然产物萜类骨架生物合成的研究报道是徐宝福研究员以共同第一作者身份参与的有关eunicellane合酶Bnd4的研究 (Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60, 14163–14170)，否定了eunicellane骨架只来源于西松烷的历史假设。而后徐宝福研究员又以第一作者身份研究了Bnd4的催化机制 (Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60, 23159–23163)，证明了其中蕴藏的氢迁移过程，并提出了一条相对合理的环化路径，即先后经过1,10和1,14两步环化。此外，徐宝福研究员参与了另一个细菌eunicellane合酶，即AlbS的研究（Chem, 2023, 9(3), 698-708. 第二作者）。研究发现，AlbS催化GGPP形成的eunicellane骨架和环化机制与之前的Bnd4都比较类似，唯一的区别是桥键的相对立体构型是反式的。在细菌来源的eunicellane合酶报道后，美国著名海洋天然产物生物合成专家Bradley S. Moore与Eric W. Schmidt在Nature Chemical Biology杂志上背靠背报道了珊瑚来源的eunicellane合酶EcTPS1和BaTC-2 (Nat. Chem. Biol., 2022, 18, 659–663. 和Nat. Chem. Biol., 2022, 18, 664–669)。这两个酶是高度同源的蛋白，可以催化GGPP先经过1,14环化，两次1,2-氢迁移，最后再进行1,10环化形成eunicellane骨架。这与细菌来源的eunicellane合酶Bnd4和AlbS呈现出截然不同的催化机制。此外，虽然珊瑚来源的EcTPS1/BaTC-2催化形成的桥键位置的相对构型是顺式的，但绝对立体构型整体和Bnd4产物是相反的（图2）。

图2. 已报导的eunicellane合酶的活性与环化路径。

在针对eunicellane的一系列研究过程中，研究人员发现了细菌来源的eunicellane的骨架呈现出动态的构象转变现象，而珊瑚来源的eunicellane骨架呈现出稍弱化的构象转变现象。这启发他们猜测eunicellane骨架的构型和构象可能存在一定的因果关系。为了探索其中的奥秘，他们致力于发现一个非柔性eunicellane合酶，并以此为基础对eunicellane骨架的构型和构象的因果关系问题进行探究。

研究人员利用基因组挖掘技术成功找到了可以催化二萜前体GGPP形成非柔性eunicellane骨架的功能酶，MicA。初步核磁结果表明，MicA催化形成的化合物（1，microeunicellene，）与其他eunicellane骨架催化形成的产物截然不同，是非常尖锐的信号，指示其非柔性特性。他们随之利用核磁、质谱、环氧衍生化和X射线单晶衍射等技术确定了eunicellane产物的立体化学结构（图3）。

图3. MicA的活性表征

随之研究人员开始探究eunicellane骨架的构象与构型之间的因果关系。为了深入理解这一现象，他们首先合成了自然界中已知的所有eunicellane合酶，包括Bnd4、AlbS和EcTPS1，以便对比分析不同eunicellane骨架的构象比例差异。核磁谱图显示，由Bnd4、AlbS和EcTPS1催化形成的化合物6–8的谱图呈现出由宽变窄的趋势，这表明这些化合物存在着多种构象。相比之下，由MicA催化生成的化合物1的谱图则非常尖锐，显示出其存在着优势构象（图4）。研究人员通过比较分析指出，这些化合物的关键区别在于C1、C2和C10的立体构型。特别是，MicA催化生成的eunicellane化合物在C2位置具有顺式双键（cis），而在C1和C10位置则为反式构型（trans）。基于这些发现，研究人员推测这三个碳原子的构型组合可能是影响eunicellane骨架构象分布的关键因素。

图4. 化合物1，6–8的13C核磁谱图（298K）

为了验证他们的推测，研究人员采用了量子化学计算的方法。他们计算了在不同构型组合下eunicellane骨架的构象玻尔兹曼分布，这些构型组合包括：C2为反式双键而C1和C10为顺式构型（trans, cis）；C2和C1、C10均为反式双键（trans, trans）；C2和C1、C10均为顺式双键（cis, cis）；以及C2为顺式双键而C1和C10为反式构型（cis, trans）。计算结果揭示了一个引人注目的发现：当构型组合为cis，trans时，所研究的eunicellane骨架（如化合物1）具有优势构象，其构象占比高达99.3%（图5）。该结果支持了研究团队的初步推测。

图5. 化合物1，6–8的玻尔兹曼分布

进一步，研究人员运用了Metadynamics自由能计算方法，以深入了解其构象变化。计算结果表明，microeunicellene的优势构象1（占玻尔兹曼分布的99.3%）与次要构象2（占玻尔兹曼分布的0.7%）之间存在大约3 kcal/mol的能量差。要从构象2转变为构象1，需要克服大约7.5 kcal/mol的能量壁垒。尽管两种构象可以相互转换，但构象1仍然是优势构象（图6）。这一发现与研究人员进行的变温核磁共振（NMR）实验结果相吻合。当温度升高至328K（55 ℃）时，microeunicellene的NMR谱图出现了变宽的现象，这表明microeunicellene的构象发生了变化。

图6. Microeunicellene（1）的Metadynamics自由能计算

此外，研究人员发现microeunicellene的构象的关键区别在于六元环上末端双键的空间朝向。与此同时，其他构型组合的eunicellane骨架的不同构象之间的主要差异则体现在十元环上C19位甲基的空间取向。值得注意的是，microeunicellene的构象具有一个显著的特征：其二面角（C9-C10-C1-C2）大于130°，而其他构型组合eunicellane骨架的构象的二面角χ1（C9-C10-C1-C2）均小于90°（图7）。基于这些观察结果，研究人员推测，C2位置的顺式双键以及C1和C10位置的反式构型的组合，共同影响了C1–C2、C1–C10和C9–C10键的旋转，从而增大了二面角，减少了十元环内剩余键的旋转，最终降低其结构的柔性。

图7. 化合物1，6–8的构象的二面角（C9-C10-C1-C2）

紧接着，研究人员又从环化路径和蛋白结构基础层面对MicA的催化机理进行了探索。通过同位素标记实验和量子化学计算，研究人员验证了MicA的催化机制：GGPP首先异构化生成2Z-GGPP或GLPP，接着进行1,14环化，随后发生两次1,2-氢迁移，再进行1,10环化，最后通过去质子化形成eunicellane骨架。有趣的是，研究人员发现，细菌来源的euniucellane合酶MicA的催化机制区别于细菌来源的Bnd4和AlbS，反而与珊瑚来源的EcTPS1/BaTC-2催化机制类似。

图8. 中间体和过渡态及其相对自由能

研究人员进一步探究了MicA催化的蛋白结构基础。首先，他们对MicA的蛋白结构进行预测，并加入了镁离子以模拟其活性状态，然后与底物GGPP进行分子对接。对活性位点的氨基酸进行突变，研究人员发现了两个关键的氨基酸残基：V220和L221（图9a）。当这两个氨基酸发生突变时，产物的C2位顺式双键变成了反式双键。这意味着GGPP不再通过异构化生成2Z-GGPP和GLPP，而是直接进行1,14环化。这表明V220和L221可能对控制2位双键的构型起着关键作用。有趣的是，V220突变后的产物在酸性硅胶的催化下能够进一步发生环化，生成6/6/6的三环体系。而L221突变后的产物仅进行了1,14环化，没有进行后续的1,10环化，最终生成了十四元环的西松烷结构（图9b）。

图9. MicA中的氨基酸残基V220和L221（a）及其突变体活性（b）

总结来说，该研究利用基因组挖掘技术成功找到了可以催化二萜前体GGPP形成非柔性eunicellane骨架的功能酶MicA，并对其活性进行了表征。通过对比MicA与其他已知的eunicellane合酶产物，并结合量子化学计算和变温核磁等实验手段，文章提出了eunicellane二萜骨架柔性的调控机制：eunicellane骨架中桥接碳原子的立体化学特性（顺式/反式）以及相邻双键的立体化学特性（顺式/反式）共同决定了骨架的柔性。通过选择合适的桥接碳原子和相邻双键的立体构型，可以合成具有特定柔性的eunicellane二萜骨架。同时，文章通过同位素标记实验和量子化学计算等方法，确定了MicA的催化机制，并将其与已知其他eunicellane合酶的催化机制进行了比较，从而加深了对eunicellane二萜类化合物生物合成途径的理解。该研究还进一步研究了其蛋白结构基础，突变V220和L221后，产物结构发生变化，提示这两个残基可能参与调控产物立体化学。这些研究发现不仅有助于我们进一步理解不同类型eunicellane合酶的催化机制，并且对于从化学合成方面调控eunicellane骨架的构象分布等具有重要的意义，也为将来eunicellane家族天然产物的合成生物学体系构建积累了生物学元件。

该论文的共同第一作者为中国海洋大学-烟台新药创制山东省实验室联培博士生李金凤（导师王长云、郭跃伟、徐宝福）、烟台新药创制山东省实验室博后陈宝博士（徐宝福团队）、付尊蕴博士（郑明月团队）和南京中医药大学-中国科学院上海感染与免疫研究所联培博士生冒婧敬（王程远团队）。徐宝福团队的刘丽君和陈晓辰对此工作也做出了一定贡献。感谢中国科学院上海药物研究所的郑明月研究员及其博后付尊蕴博士在化学计算方面做出的重要贡献。感谢美国佛罗里达大学Jeffrey D. Rudolf教授提供的意见和帮助。徐宝福研究员、郭跃伟研究员、中国科学院上海感染与免疫研究所王程远研究员和中国海洋大学王长云教授为该论文的共同通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划、国自然重点项目、泰山学者项目、山东省实验室专项、山东省自然重大基础项目和上海白玉兰人才计划浦江项目等项目和单位的资助。

徐宝福研究员特别感谢烟台新药创制山东省实验室海洋药物中心主任郭跃伟研究员在项目引荐和技术骨干成员推荐等方面提供的无私奉献与支持。

此外，徐宝福研究员也向原中国科学院上海分子卓越中心肖友利研究员（已故）表达深深怀念之情，感谢其在作为博士导师期间对自己的培养。

徐宝福团队主要开展萜类化合物基因组导向的发现与生物合成研究，涉及生物材料包括海洋动物、植物及其共生微生物等。该团队依托基因组学、转录组学技术、生物催化及发酵技术，致力于完成发现-解析-生产的核心科研使命：即活性萜类天然产物的发现、生物合成的解析、以及最后利用合成生物学理念实现化合物的绿色高效可持续生产，以驱动原创萜类新药的开发。

徐宝福实验室介绍链接：http://chemxulab.com

全文链接： https://www.nature.com/articles/s41467-024-50209-z

（供稿部门：徐宝福课题组）